Геликаза-зависимая амплификация

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
(перенаправлено с «Геликаз-зависимая амплификация»)
Данная страница не проверялась участниками с соответствующими правами.
Перейти к навигации Перейти к поиску

Гелика́за-зави́симая амплифика́ция (англ. helicase-dependent amplification, HDA), также гелика́за-зави́симая изотерми́ческая амплифика́ция, — это метод амплификации ДНК in vitro, который, в отличие от полимеразной цепной реакции, осуществляется при постоянной температуре.

Введение

[править | править код]

Полимеразная цепная реакция является наиболее широко используемым методом амплификации ДНК in vitro в молекулярной биологии и биомедицинских исследованиях[1]. Этот процесс включает разделение двухцепочечной ДНК при высокой температуре на одноцепочечную (этап денатурации, обычно достигаемый при 95-97 °C), отжиг праймеров к одноцепочечной ДНК (этап отжига) и копирование одноцепочечной ДНК для создания новой двухцепочечной ДНК (этап удлинения, для которого требуется ДНК-полимераза), что требует проведения реакции в термоциклере. Эти настольные машины большие, дорогие и требуют больших затрат на эксплуатацию и обслуживание, что ограничивает применение амплификации ДНК в ситуациях вне лаборатории (например, при идентификации потенциально опасных микроорганизмов на месте расследования или при оказании помощи пациенту). Хотя ПЦР обычно ассоциируется с термоциклированием, в оригинальном патенте Mullis et al. раскрыто использование геликазы в качестве средства для денатурации двуцепочечной ДНК, что включает изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот. В естественных условиях ДНК реплицируется ДНК-полимеразами с различными вспомогательными белками, включая ДНК-геликазы, которые разделяют цепи ДНК путём раскручивания двойной спирали ДНК[2]. Метод HDA был разработан на основе этой концепции, и использует геликазу для денатурации ДНК.

Методология

[править | править код]

Нити двухцепочечной ДНК сначала разделяются ДНК-геликазой и покрываются белками, связывающими одноцепочечную ДНК (ssDNA). На втором этапе два праймера, специфичные для конкретной последовательности, гибридизуются с каждой границей шаблона ДНК. Затем ДНК-полимераза используется для удлинения праймеров, отжигаемых на шаблонах, для получения двухцепочечной ДНК, а два вновь синтезированных продукта ДНК затем используются в качестве субстратов ДНК-геликазой, вступая в следующий раунд реакции. Таким образом, развивается одновременная цепная реакция, приводящая к экспоненциальной амплификации выбранной целевой последовательности (схему см. в Vincent et al., 2004[3]).

Преимущества и недостатки HDA

[править | править код]

С момента публикации своего открытия технология HDA используется для выявления ДНК Clostridium difficile[4]; кроме того разработан тест для выявления золотистого стафилококка[5]. Преимуществом HDA является то, что он обеспечивает возможность быстрой амплификации целевых нуклеиновых кислот при изотермических условиях и не требует использования термоциклера и, следовательно, позволяет проводить исследования в полевых условиях. Однако большая часть работы, необходимой для выявления потенциально опасных микроорганизмов, проводится в исследовательских/больничных лабораториях. Массовая диагностика по большому количеству образцов всё ещё не может быть достигнута с помощью HDA, в то время как ПЦР-реакции, проводимые в термоциклере, вмещающем многолуночные планшеты, позволяют амплифицировать целевую ДНК в десятках или даже сотнях образцов. Кроме того, реагенты для HDA, часто поставляемые в виде готовых наборов, cтоят дороже, чем стандартные реагенты для ПЦР.

См. также

[править | править код]

Примечания

[править | править код]
  1. ↑ Saiki RK, et al. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839): 487–491. doi:10.1126/science.239.4839.487. PMID 2448875.
  2. ↑ DNA Replication, 2nd edn. — WH Freeman and Company: New York, 1992. — ISBN 978-1-891389-44-3.
  3. ↑ Vincent M, Xu Y, Kong H (2004). Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5 (8): 795–800. doi:10.1038/sj.embor.7400200. PMC 1249482. PMID 15247927.
  4. ↑ Chow WH, McCloskey C, Tong Y, Hu L, You Q, Kelly CP, Kong H, Tang YW, Tang W (2008). Application of isothermal helicase-dependent amplification with a disposable detection device in a simple sensitive stool test for toxigenic Clostridium difficile. J Mol Diagn. 10 (5): 452–8. doi:10.2353/jmoldx.2008.080008. PMC 2518740. PMID 18669881.
  5. ↑ IsoAmp Rapid Staph Detection Kit (product description). Biohelix corp.. Архивировано из оригинала 10 октября 2009 года.
  6. ↑ United States Patent 7,972,820. July 5, 2011. Isothermal amplification of nucleic acids on a solid support

Ссылки

[править | править код]
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Геликаза-зависимая_амплификация&oldid=147096551