免疫标记

免疫标记——通过带标签的特异性抗原抗体检测组织中的抗原

免疫标记是一种生化方法，用于检测并定位细胞、组织或器官内特定部位的抗原。抗原通常是有机分子，多为蛋白质，能够与抗体特异性结合。通过将抗原特异性抗体与一种检测手段（即“标记”）结合，抗原即可被可视化，该“标记”通常通过共价键连接在抗体上。当免疫标记用于揭示细胞或其亚结构相关信息时，这一过程称为免疫细胞化学（immunocytochemistry）；若用于较大组织结构，则称为免疫组织化学。

在制备用于免疫标记的抗体过程中，存在两个复杂步骤：首先，需要获得能与目标抗原特异结合的抗体；其次，是将标记物与抗体连接。由于几乎不可能为所有抗原特异性抗体逐一结合标记，因此大多数免疫标记采用间接检测方法。在这种方法中，首先使用能特异识别抗原的一抗，然后再使用与标记物结合的二抗，该二抗能够特异性识别并结合一抗。通过这种方式，二抗可以实现规模化生产并商品化供应。在实验操作中，研究者先将一抗加入检测系统，使其结合目标抗原，再引入带有标记的二抗，二抗随后与一抗特异结合。

常用的标记物包括：荧光化合物、金颗粒、特定表位标签、或能催化生成有色产物的酶。通过抗体介导将标记物与目标抗原结合，研究者可以在组织原位（如细胞膜、细胞质或核膜）实现对抗原的识别和可视化。在某些条件下，该方法还可适用于定量分析。

免疫标记广泛应用于药理学、分子生物学、生物化学等多个领域，凡需明确抗体可结合分子的精确定位时，均可采用此方法。

间接与直接法

免疫标记涉及两种方法：直接法和间接法。在直接免疫标记方法中，标签直接与一抗（原抗体）结合。直接法在减少交叉反应方面具有优势，交叉反应是一种所有抗体固有的非特异性现象，并且每增加一种用于检测抗原的抗体，这种非特异性反应就会累积。然而，直接法在实验室中并不常用，其实用性远低于间接法。这是因为一抗必须进行共价标记，而这需要大量纯化抗体的供应。直接法的敏感性通常远低于间接法。间接法的原理是，多个二抗（次级抗体）可以结合到单个一抗的不同区域或结构域上，每个抗原因此能结合更多带标签的抗体，从而产生更强的信号。抗原结合的标签越多，每个抗原的检测信号就越强。

为了实现高特异性和高灵敏度，可以采用不同的间接法策略。首先，经常使用两步法，以避免多种一抗和二抗混合免疫标记之间的交叉反应，通常使用二抗的Fab片段以降低非特异性结合。其次，可采用半抗原化的一抗，此时二抗识别的是与一抗结合的半抗原。半抗原通过琥珀酸共价连接到一抗，或与IgG Fc特异性Fab段共轭。最后，不同Ig亚型的一抗单克隆抗体可以通过针对特定亚型的二抗进行检测。

抗体结合与特异性

总体而言，抗体必须以高特异性和高亲和力与抗原结合.。抗体结合的特异性是指抗体能够识别并仅结合单一靶抗原的能力。科学家通常使用单克隆抗体或多克隆抗体，这些抗体可由合成肽构成。在抗体制备过程中，通过将抗原肽固定在亲和柱上，使非特异性抗体直接流过，从而富集特异性抗原抗体。这一过程降低了抗体与初始肽上未存在的抗原表位结合的可能性。因此，抗体的特异性是通过其与用于免疫的蛋白质或肽的特异反应建立的，可采用免疫印迹或免疫沉淀等特定方法进行验证。

在确定抗体特异性时，关键因素是所使用的合成肽或纯化蛋白的类型。抗体的特异性越低，出现识别非目标抗原信号的可能性就越大。对于合成肽而言，其优势在于氨基酸序列易于获得，但这些肽并不总是呈现天然蛋白的三维结构或翻译后修饰。因此，针对合成肽产生的抗体在识别天然三维蛋白时可能存在问题。这类抗体在免疫沉淀或免疫组织化学实验中可能表现不佳，但在免疫印迹实验中仍可能结合蛋白的变性形式。相反，如果抗体在识别天然纯化蛋白时效果良好，而对变性蛋白无效，则免疫印迹实验就无法作为判断抗体结合特异性的标准测试，尤其是在免疫组织化学中。

特异性免疫标记技术

光学显微镜

光学显微镜是利用光线观察放大标本的仪器。通常使用复合光学显微镜，其通过目镜和物镜两组透镜的协同作用，实现对标本的放大观察。光学显微镜在研究中常结合免疫标记技术，用于观察特定的组织或细胞。例如，有研究利用光学显微镜及其他电子显微镜方法，观察垂体腺瘤细胞培养的形态及激素分泌情况。研究结果显示，原代腺瘤细胞培养在体外仍保持其生理特性，与组织学检查结果相符。研究还通过光学显微镜和免疫细胞化学方法观察人垂体腺瘤的细胞培养，将细胞固定后，用针对人类生长激素（GH）的单克隆小鼠抗体及针对泌乳素（PRL）的多克隆兔抗体进行免疫标记。这一实例说明，通过光学显微镜及其他电子显微镜技术观察免疫标记的垂体腺瘤细胞培养，有助于肿瘤的准确诊断。

电子显微镜

电子显微镜的放大倍率可达两百万倍，而光学显微镜的放大倍率仅为1000至2000倍。电子显微镜主要分为两类：透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。

电子显微镜常结合免疫标记技术，用于观察带有特定标记的组织或细胞。其原理与光学显微镜下的免疫标记基本相同，即通过特定抗体识别目标抗原的位置，再通过电子显微镜进行观察。与光学显微镜相比，电子显微镜的优势在于能够在亚细胞水平上直接观察目标区域。通常，在电子显微镜观察中使用高电子密度的重金属材料，它能够有效反射入射电子。免疫标记通常先通过光学显微镜确认抗原的存在，再进一步采用电子显微镜进行详细观察。

免疫标记结合电子显微镜技术常用于染色体的观察。有研究探索免疫标记染色体结构的改进方法，如拓扑异构酶 IIα（topoisomerase IIα）和凝缩蛋白（condensin）在分离的有丝分裂染色体中的分布情况。研究者通过对分离的细胞核进行紫外线照射，或通过高水平特异性免疫标记，揭示染色体的辅助结构，并利用电子显微镜进行观察。

透射电子显微镜

透射电子显微镜（TEM）利用电子束穿过组织薄片形成二维图像。图像中亮度越高的区域，表明有更多电子能够透过样本。TEM已被广泛用于观察经过免疫标记的组织和细胞。例如，通过免疫标记处理后，细菌可以在TEM下清晰可见。一项研究利用TEM结合负染和免疫标记技术，分析了不同大肠杆菌菌株中CS3和CS6菌毛的结构。具体而言，对菌毛的免疫标记验证了不同表面抗原的存在。

扫描电子显微镜

扫描电子显微镜（SEM）是一种利用扫描电子束获取样品图像的显微技术。尽管观察到的图像呈现三维效果，但实际上并非真正的三维。该显微镜通过将电子束集中于样品的极小区域（约2–3纳米）上，激发样品释放二次电子。释放的二次电子被传感器捕捉，从而在一定时间内生成样品的图像。

扫描电子显微镜是常用的免疫标记技术之一。SEM能够以高分辨率检测细胞组分的表面结构。这种免疫标记方法与免疫荧光技术非常相似，不同之处在于它使用胶体金标记取代荧光团。总体思路也非常相似：首先使用未标记的一级抗体，然后依次加入针对一级抗体的标记二级抗体。

在将SEM与金粒子免疫标记结合使用时，偶尔会遇到电子束下粒子和电荷分辨率的问题；随着SEM仪器技术的发展，采用背散射电子成像的方法，这一分辨率问题已得到有效解决。这是因为电子背散射衍射图案能够提供一个干净的样品表面，使其与主电子束充分作用，从而改善图像质量。

免疫金标记

金粒子免疫标记，也称为免疫金染色，常用于扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）研究中，以精确定位细胞或组织中抗原的分布位置。这一技术最早由Faulk和Taylor发表，他们通过一步法将金粒子标记到抗沙门氏菌兔伽玛球蛋白上，从而成功识别沙门氏菌抗原在细胞中的位置。

研究表明，为了在低倍显微观察中清晰呈现细胞，金粒子的尺寸需要放大（>40 nm），但粒子过大可能降低金标结合的效率。科学家们认为，应使用较小的金粒子（1–5 nm），并通过银增强法进行放大。尽管四氧化锇染色可能会刮掉银层，但金粒子增强后则不易受到四氧化锇的影响。因此，在不同基质的细胞粘附研究中，可通过金粒子的增强实现免疫金标记的有效应用。

未来应用

研究显示，免疫标记技术与指纹检测具有一定的兼容性。在一些情况下，指纹的脊线图案不够清晰，难以进行识别。免疫标记可能为法医人员提供一种手段，用以缩小嫌疑人的范围。研究人员开展了一项实验，测试了免疫标记技术与多种指纹显现方法的兼容性。结果表明，吲哚酮-锌（IND-ZnCl）、吲哚酮-锌后施用茚三酮喷雾（IND-NIN）、物理显影法（PD）、氰基丙烯酸酯熏蒸法（CA）、氰基丙烯酸酯后结合基本黄染色（CA-BY）、荧光氰基丙烯酸酯熏蒸（Lumi-CA）以及多聚氰基丙烯酸酯熏蒸（Poly-CA）均与免疫标记技术兼容。免疫标记不仅能够从指纹中提取供体的生物学特征信息，还能提升指纹图像的质量，这两方面在刑事案件中均具有重要的应用价值。